摘要

顳葉素是最早從歐洲紅蛙（Rana temporaria）的皮膚中分離出的短（10-13個(gè)氨基酸）線性抗菌肽，對革蘭氏陽性細(xì)菌和白色念珠菌有效。為了深入了解其作用機(jī)制，我們比較了該家族的兩個(gè)成員對模型膜的影響，即。，temporin B（LLPIVGNLLKSLL-NH2）和temporin L（FVQWFSKFLGRIL-NH2）。更具體地說，我們測量了它們插入脂質(zhì)單分子膜以及它們對脂質(zhì)體雙層結(jié)構(gòu)動力學(xué)的影響，如二苯基己三烯（DPH）和芘標(biāo)記的磷脂所揭示的。我們還觀察了這些肽對巨大囊泡拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的影響。這兩種時(shí)間蛋白都很容易滲透到脂質(zhì)單層中，在常見細(xì)菌帶負(fù)電的磷脂-磷脂酰甘油的存在下，它們的嵌入作用增強(qiáng)。相反，真核細(xì)胞脂質(zhì)膽固醇確實(shí)在一定程度上抵消了它們滲透到脂質(zhì)膜中的作用。temporin B和temporin L均導(dǎo)致磷脂在雙層中富集，并且在1-棕櫚酰-2-油?；?sn-甘油-3-磷酸甘油（POPG）存在下，這些肽增加了酰基鏈順序。Temporin B實(shí)際上對由1-硬脂酰-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿（SOPC）組成的巨大脂質(zhì)體沒有影響，而當(dāng)存在POPG時(shí)觀察到快速發(fā)泡。相反，temporin L誘導(dǎo)SOPC和SOPC/POPG巨囊泡形成，而SOPC巨囊泡中膽固醇的存在減弱了這種作用。

抗菌肽廣泛分布于自然界，是無脊椎動物和脊椎動物天然免疫的重要組成部分，可防止多種有害微生物的入侵和增殖。尤其是無尾類動物（青蛙和蟾蜍）的皮膚是抗菌肽的豐富來源，其結(jié)構(gòu)和活性譜都具有很大的多樣性（1，2）。通常大量生產(chǎn)，幾種具有不同抗菌特性的不同肽通常存在于單個(gè)動物的皮膚提取物中。這種多樣性被認(rèn)為對保護(hù)青蛙免受更廣泛的有害入侵者的侵害很重要（3）。蛙皮抗菌肽是在稱為顆粒腺的特殊皮膚結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生和儲存的，在腎上腺素能刺激或皮膚損傷時(shí)釋放其內(nèi)容物。一大類不斷擴(kuò)大的蛙抗菌肽，統(tǒng)稱為前表皮抑制素，已被證明具有高度保守的N端前序列和具有與抗菌肽對應(yīng)的可變序列的C端結(jié)構(gòu)域（4）。

目前，對蛙皮和其他來源的抗菌肽進(jìn)行了深入研究，以闡明其作用機(jī)制。作為這項(xiàng)工作的結(jié)果，抗菌肽通常被認(rèn)為通過滲透或破壞細(xì)胞膜的穩(wěn)定性來殺死靶細(xì)胞，無論是原核細(xì)胞還是真核細(xì)胞。然而，精確的機(jī)制仍不完全清楚。關(guān)于抗菌肽與生物膜和模型膜的相互作用，最近有許多優(yōu)秀的綜述，提供了迄今為止提出的用于解釋肽誘導(dǎo)的膜滲透過程的不同模型的完整視圖（5-8）。

顳蛋白是一類抗菌肽，首先從歐洲紅蛙的皮膚中分離出來（9）。最近，在林蛙屬其他物種的皮膚提取物中發(fā)現(xiàn)了顳蛋白家族的新成員，即。，R、clamitans（10）、luteiVentris（11）、pipiens（11）和grylio（12）。因此，這些發(fā)現(xiàn)也可以深入了解這些肽在相關(guān)物種之間的進(jìn)化和分化（10，11）。顳蛋白是具有凈正電荷和酰胺化C端的線性10-13殘基長肽，在非極性溶劑（如三氟乙醇）中可能呈現(xiàn)兩親R螺旋構(gòu)象（9，13）。發(fā)現(xiàn)時(shí)間蛋白A和B對大腸桿菌細(xì)胞壁缺陷突變株也有活性，并釋放脂質(zhì)體包埋的熒光探針（9，13）。該家族的一個(gè)成員，時(shí)間蛋白D，對紅細(xì)胞有溶解作用（13）。最近對兩種不同的顳蛋白B對映體在糞便環(huán)境中的穩(wěn)定性進(jìn)行的研究表明，肽的D異構(gòu)體的失活速度比L異構(gòu)體慢（14）。因此，當(dāng)考慮治療用途時(shí)，D異構(gòu)體可能更可取。

顳蛋白與脂質(zhì)的相互作用尚未得到詳細(xì)研究。為了更深入地了解這些肽的作用模式，并將其與我們實(shí)驗(yàn)室先前研究過的其他兩種抗菌肽（15）馬蓋寧2和吲哚肽進(jìn)行比較，我們研究了顳蛋白B（LLPIVGNLLKSLL-NH2）和顳蛋白L（FVQWFSKFLGRIL-NH2）與模型膜的相互作用。更具體地說，我們研究了它們插入脂質(zhì)單層的能力，使用二苯基己三烯（DPH）1和芘標(biāo)記的磷脂對脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)動力學(xué)的影響，以及對巨大脂質(zhì)體形態(tài)的影響。

材料和方法

材料。Hepes和EDTA來自Sigma。1-硬脂酰-2-油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿（SOPC）、1-棕櫚酰-2-油?；?sn-甘油-3-磷酸甘油（POPG）和–膽固醇來自Avanti極性脂質(zhì)（Alabaster，AL）。熒光磷脂類似物1-棕櫚酰-2-[10-（芘-1-基）癸?；鵠-sn-甘油-3-磷酸膽堿（PPDPC）來自K&V Bioware（芬蘭埃斯波）和EGA Chemie（德國斯坦海姆）的二苯基己三烯（DPH）。使用高精度電子天平（Cahn、Cerritos、CA）通過重量法測定未標(biāo)記脂質(zhì)的濃度，并通過341 nm處的吸光度，分別使用38000和88000 cm-1的摩爾消光系數(shù)測定含芘磷脂和DPH的濃度。在用氯仿/甲醇/水（65:25:4，v/v/v）開發(fā)的硅酸涂層板（德國達(dá)姆施塔特默克公司）上，通過薄層色譜法檢查脂質(zhì)的純度。碘染色后以及在適當(dāng)情況下，紫外線照射后對平板進(jìn)行檢查，未發(fā)現(xiàn)任何雜質(zhì)。合成顳葉素從塔納實(shí)驗(yàn)室（德克薩斯州休斯頓）購買。通過HPLC分析肽的純度（顳蛋白B和顳蛋白L的純度分別大于90%和大于94%），并通過自動Edman降解和質(zhì)譜驗(yàn)證其序列。通過重量法和定量離子交換柱色譜法以及茚三酮衍生法測定肽濃度。

肽對脂質(zhì)單層的滲透。使用磁力攪拌的圓形聚四氟乙烯孔（多孔板，亞相體積1.2 mL，Kibron Inc.，芬蘭赫爾辛基）測量肽插入位于空氣/水界面上的脂質(zhì)單層。表面壓力（π）通過連接到連接到奔騰PC的微量天平（DeltaPi，Kibron Inc.）上的Wilhelmy線進(jìn)行監(jiān)測。所示脂質(zhì)以氯仿（約1 mg/mL）的形式擴(kuò)散到空氣/緩沖液（5 mM Hepes，0.1 mM EDTA，pH 7.0）界面上。隨后，在將temporins（0.3μM最終濃度）注入亞相之前，允許脂質(zhì)單層在不同初始表面壓力（π0）下沉淀約15分鐘。注射肽后π的增量在大約30分鐘內(nèi)完成，初始表面壓力（π0）與肽滲透到膜中后觀察到的值之間的差值取為?π.數(shù)據(jù)表示為?πvsπ0。這些圖還得出了與阻止肽插入膜中的脂質(zhì)側(cè)向堆積密度相對應(yīng)的臨界表面壓力πc。所有測量均在環(huán)境溫度下進(jìn)行，一式三份(≈+24°C）。

制備大的單層囊泡（LUV）。將適量的脂質(zhì)儲備溶液混合在氯仿中以獲得所需的組合物，其中PPDPC（X）0.01）或DPH（X）0.002）包括作為熒光探針。在氮?dú)饬飨氯コ軇S后在減壓下將脂質(zhì)殘留物保持至少2小時(shí)。然后在50°C下將干脂質(zhì)在5 mM Hepes、0.1 mM EDTA、pH 7.0中水合，以產(chǎn)生1 mM的脂質(zhì)濃度。使用Liposofast低壓均質(zhì)器（加拿大渥太華Avestin）通過兩個(gè)聚碳酸酯過濾器（孔徑100 nm，Bedford，MA）堆疊擠出所得分散體，以獲得平均直徑在111和117 nm之間的大單層囊泡（17）。

Ie/Im的測量。芘的輻照≈344 nm產(chǎn)生單體激發(fā)態(tài)，該激發(fā)態(tài)通過發(fā)射最大值為的光子松弛回到基態(tài)≈398 nm（Im），精確的峰能量和光譜結(jié)構(gòu)取決于溶劑極性。如果芘的局部濃度足夠高，激發(fā)單體可能與基態(tài)芘碰撞，形成激發(fā)二聚體（準(zhǔn)分子）。準(zhǔn)分子通過發(fā)射以中心為中心的寬而無特征的量子帶，解離回兩個(gè)基態(tài)芘≈480納米（18，19）。用Perkin Elmer LS50B熒光光譜儀和磁力攪拌恒溫反應(yīng)杯室測量用PPDPC（X）0.01）標(biāo)記的LUV的熒光發(fā)射光譜。激發(fā)和發(fā)射均使用4 nm的帶寬。使用的脂質(zhì)濃度為20μM，溫度保持在25°C。添加適量肽后，在記錄光譜之前，樣品平衡5分鐘。取三次掃描的平均值，并分別測量Im和Ie處的發(fā)射強(qiáng)度?！秩?98和480 nm進(jìn)行

DPH的熒光各向異性（r）。DPH在X）0.002處包含在脂質(zhì)體中。使用的脂質(zhì)濃度為20μM，溫度保持在25°C。使用帶有Perkin Elmer LS50B的寶麗來膜式過濾器以L格式測量極化發(fā)射。使用10 nm帶寬，在360 nm激發(fā)和450 nm發(fā)射下測量DPH的熒光各向異性r，并使用Perkin Elmer提供的軟件例程計(jì)算其值。

形成巨大脂質(zhì)體。如其他地方所述（20-22）制備了巨大脂質(zhì)體。將溶解在二乙醚/甲醇（9:1，v/v，濃度為1 mM）中的約1-3μL指示脂質(zhì)攤鋪在兩個(gè)鉑電極的表面上，然后在氮?dú)饬飨赂稍?。通過在真空中抽空1小時(shí)來去除可能的有機(jī)溶劑殘留。在蔡司IM-35倒置熒光顯微鏡的工作臺上放置一個(gè)帶有連接電極和石英窗口底部的玻璃室。在添加1.3 mL pH值為7.4的0.5 mM Hepes緩沖液之前，施加交流電場（頻率為4 Hz、振幅為0.2 V的正弦波函數(shù)）。在水合作用的第一分鐘內(nèi)，電壓增加到1.0 V。2小時(shí)后關(guān)閉交流電場，使用霍夫曼調(diào)制對比度（HMC）光學(xué)系統(tǒng)觀察到巨大的脂質(zhì)體，其物鏡為10×/0.25（modulation optics Inc.，紐約）。巨大脂質(zhì)體的大小是通過微管的運(yùn)動校準(zhǔn)圖像，將其作為微操作器步長（50 nm）的適當(dāng)倍數(shù)（帶有MC2000控制器的MX831、SD儀器、Grants Pass或）。使用珀?duì)栙N冷卻的12位數(shù)字CCD攝像機(jī)（C4742-95，日本濱松）與計(jì)算機(jī)連接，并通過攝像機(jī)制造商提供的軟件（HiPic 5.0.1）進(jìn)行操作，記錄圖像。

微量注射技術(shù)。內(nèi)部尖端二聚體>0.5μm（23）的微移液管由硼硅酸鹽毛細(xì)管（外徑1.2 mm）通過微處理器控制的水平拉拔器（P-87，Sutter Instrument Co.，Novato，CA）制成。將指示量的肽溶液（10 mM Hepes中的0.5 mM，0.1 mM EDTA，pH 7.0）施加到單個(gè)巨大脂質(zhì)體的外表面，作為一系列約20 fL的單次注射，用氣動微注射器（PLI-100，Medical Systems Corp.，Greenvale，NY）輸送。為了便于操作，只使用附著在電極表面的囊泡。所有實(shí)驗(yàn)均在環(huán)境溫度下進(jìn)行(≈+并重復(fù)至少10次。

結(jié)果

顳葉素對脂質(zhì)單層的滲透。在將配體（如肽）注射到水/氣界面上的脂質(zhì)單分子膜中后，將其插入到水/氣界面上的脂質(zhì)單分子膜中會導(dǎo)致增加?π、在表面壓力下。獲得的數(shù)據(jù)表示為?π、作為薄膜初始表面壓力的函數(shù)，π0（15，16）。表面壓力變化的幅度可用于評估肽-脂質(zhì)相互作用的相對能量，并表征肽的脂質(zhì)特異性（綜述見16）。先前采用該技術(shù)的研究表明，抗菌肽，如馬蓋寧2和吲哚肽，可以有效插入脂質(zhì)膜（15）。同樣，顳蛋白B和顳蛋白L均有效插入脂質(zhì)單層，如初始壓力（π0）為0.20）時(shí)的SOPC/POPG膜（XPOPG）所示≈15 mN/m（圖1）。然而，兩種肽表面壓力增加的動力學(xué)明顯不同。因此，在亞相中加入顳蛋白B（圖1，圖A）后，π出現(xiàn)快速瞬態(tài)峰值，然后是松弛，然后是π緩慢增加。這些動力學(xué)與脂質(zhì)成分無關(guān)，初始表面壓力在12-36 mN/m范圍內(nèi)變化。相反，對于Temporan L，表面壓力值以連續(xù)方式增加，在大約40分鐘內(nèi)達(dá)到平臺（圖1，面板B）?，F(xiàn)階段未對動力學(xué)進(jìn)行更詳細(xì)的研究。

隨后從以下方面分析了來自上述類似測量的數(shù)據(jù)：?πvsπ0（圖1，面板C和D）。時(shí)間蛋白B很容易插入到高達(dá)π0的SOPC單分子膜中≈39 mN/m，其中?π-π0數(shù)據(jù)點(diǎn)外推到?π)0.因此，該值表示該肽不再插入SOPC單層的臨界包裝壓力πc（圖1，面板c）。與其凈正電荷+2一致，當(dāng)膜中酸性磷脂POPG的含量增加時(shí)，時(shí)間蛋白B向脂質(zhì)單層的滲透逐漸增強(qiáng)（圖1，面板C），πC的值急劇增加。有趣的是，當(dāng)XPOPG在0.10和0.40之間變化時(shí)?temporin B的πvsπ0數(shù)據(jù)在表面壓力為的情況下顯示出一個(gè)“交叉”點(diǎn)≈32 mN/m。具體來說，在后一個(gè)表面壓力以下，增加?π隨著膜中POPG的增加而增加，而在π0>32mn/m時(shí)觀察到相反的情況。πc的值在序列中降低≈64,≈55，和≈當(dāng)XPOPG分別從0.10增加到0.20和0.40時(shí)，為48 mN/m（圖1，面板E）。將膽固醇（X）0.10）包含在SOPC膜中抑制了該肽在π0處插入單層≈27 mN/m（圖1，面板C），而πC增加到≈4200萬/米。

圖1：將時(shí)間蛋白B和L插入脂質(zhì)單層。在初始表面壓力（π0）分別為14.6和15.5 mN/m的情況下，在SOPC/POPG（XPOPG）0.2）單層下方注射顳蛋白B（面板a）或顳蛋白L（面板B）后，表面壓力隨時(shí)間的增加而增加。肽（0.3μM最終濃度）的添加用箭頭標(biāo)記。表面壓力增量(?π）將0.3μM顳蛋白B（圖C）或顳蛋白L（圖D）添加到亞相中導(dǎo)致的脂質(zhì)單分子膜的數(shù)量表示為初始表面壓力（π0）的函數(shù)。SOPC中POPG（XPOPG）的含量分別為0（0）、0.10（9）、0.20（b）和0.40（2）。還顯示了將肽插入具有Xchol）0.1（3）的SOPC膜中。圖E顯示了πc的值，分別作為滲透時(shí)間蛋白B（O）和時(shí)間蛋白L（B）時(shí)XPOPG的函數(shù)。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表三次測量的平均值。標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.1和0.8 mN/m之間變化，為清晰起見，未顯示。

也觀察到由于顳蛋白L，π顯著增加，表明其滲透到SOPC單層（圖1，面板D）。然而，temporin L明顯比temporin B更具膜活性，具有πc≈54 mN/m。與temporin B類似，單分子層中POPG含量的增加增強(qiáng)了temporin L的滲透性，增加了?π以下≈43 mN/m（圖1，面板D）。然而，在表面壓力的后一個(gè)“交叉”值以上，由于時(shí)間蛋白L引起的π增量被POPG略微衰減，導(dǎo)致在存在POPG的情況下πc減小，轉(zhuǎn)移到≈53,≈51，和≈XPOPG時(shí)為50 mN/m），分別為0.10、0.20和0.40（圖1，面板E）。至于顳蛋白B，由顳蛋白L引起的π增量被膽固醇（Xchol）0.10減弱，而πc從≈54至≈48 mN/m（圖1，面板D）。

顳蛋白對雙層脂質(zhì)動力學(xué)的影響。隨后通過記錄摻入LUVs的芘標(biāo)記熒光磷脂類似物PPDPC（X）0.01）的發(fā)射光譜來研究肽與脂質(zhì)體結(jié)合的后果。對于含有脂質(zhì)類似物（如PPDPC）的單個(gè)芘部分，穩(wěn)態(tài)Ie/Im值反映了膜中熒光團(tuán)的橫向遷移率和局部濃度（18，19）。然而，我們之前的研究比較了兩種其他抗菌肽（馬蓋寧2和吲哚肽）對膜脂質(zhì)動力學(xué)的影響，發(fā)現(xiàn)這些肽也影響芘標(biāo)記脂質(zhì)的量子產(chǎn)率（15）。對于SOPC LUV，添加temporin B分別導(dǎo)致芘單體和準(zhǔn)分子發(fā)射Im和Ie的顯著減少，最大減少約40%（圖2，面板a和B）。芘熒光帶的猝滅是雙相的，當(dāng)時(shí)間蛋白B與脂質(zhì)的摩爾比約為1:12時(shí)，量子產(chǎn)率顯著降低（圖2，面板a和B）。在膽固醇（Xchol）0.10）存在的情況下，temporin B對芘單體和準(zhǔn)分子熒光的猝滅也很明顯，盡管發(fā)射的減少量小于在SOPC LUV中觀察到的減少量（圖2，面板A和B）。然而，當(dāng)酸性磷脂POPG存在于XPOPG）0.10時(shí)，Im中只有微不足道的變化是明顯的，當(dāng)XPOPG從0.20增加到0.40時(shí)，時(shí)間蛋白B導(dǎo)致Im以漸進(jìn)的方式增加，Im的初始增量在大約2/1的POPG/時(shí)間蛋白B化學(xué)計(jì)量比下趨于穩(wěn)定。在達(dá)到飽和響應(yīng)之前，Im中線性增量的斜率隨著XPOPG而增加（圖2，面板C）。在POPG存在的情況下，顳蛋白B也增加了Ie。在XPOPG）0.40時(shí)，Ie的值逐漸增加，直到顳蛋白B：脂質(zhì)摩爾比為≈1：15，對應(yīng)于≈1/6，而當(dāng)超過該化學(xué)計(jì)量比時(shí)，Ie降低。圖3，面板A中顯示了由于顳蛋白B引起的Ie/Im的變化。具體而言，SOPC LUV的Ie/Im增加了1.1倍，而在膽固醇（Xchol）0.10的存在下，觀察到Ie/Im的微小變化，面板A）。將XPOPG從0.10增加到0.20會逐漸增強(qiáng)Ie/Im的增量。有趣的是，在XPOPG）0.40時(shí)，當(dāng)時(shí)間蛋白B：脂質(zhì)摩爾比為≈1:30.然而，在這一肽：脂比之上，顳葉素B導(dǎo)致Ie/Im降低，而在這一肽：脂比之上，Ie/Im的變化不顯著≈1:6.

圖2：通過芘標(biāo)記的磷脂PPDPC（X）0.01的熒光評估顳葉素B對LUV中脂質(zhì)動力學(xué)的影響，分別顯示為芘單體和準(zhǔn)分子發(fā)射強(qiáng)度Im（圖A），Ie（圖B）的變化，以及在RFIm中達(dá)到飽和反應(yīng)之前Im增加的斜率（圖C）。脂質(zhì)體由SOPC組成，XPOPG為0（0）、0.10（9）、0.20（b）和0.40（2），Xchol為0.10（3）?？傮w積為2 mL的5 mM Hepes，0.1 mM EDTA，pH 7.0，脂質(zhì)濃度為20μM。使用循環(huán)水浴將溫度保持在25°C。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表三次測量的平均值。標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.02（面板A和B）和0.004（面板C），為清晰起見，未顯示。

芘標(biāo)記的脂質(zhì)PPDPC的Ie/Im增強(qiáng)通常被評估為是由于探針的側(cè)向分離或脂質(zhì)側(cè)向擴(kuò)散速率增加所致。為了解決這兩種相互非排斥機(jī)制之間的矛盾，我們測量了膜中DPH的穩(wěn)態(tài)熒光各向異性r（圖3，面板B）。DPH是一種小的、疏水的桿狀熒光團(tuán)，其中很大一部分位于雙層的碳?xì)浠衔飬^(qū)域，平行于膜脂的長軸。其發(fā)射各向異性可用于評估酰基鏈順序（有關(guān)綜述，請參閱24）。增加脂質(zhì)堆積后，觀察到?；滍樞蛟黾樱瑥亩鴾p少脂質(zhì)側(cè)向擴(kuò)散（25，26）。顳葉素B對SOPC和SOPC/膽固醇（Xchol）0.10）LUVs的r僅產(chǎn)生了微不足道的變化（圖3，面板B）。因此，SOPC-luv的?；滍樞驔]有變化以及Ie/Im的增加表明PPDPC很可能富集到微域中。隨著XPOPG的增加，添加顳蛋白B后，脂質(zhì)堆積和?；滍樞蛑饾u增強(qiáng)。因此，膜橫向擴(kuò)散的增加不能導(dǎo)致觀察到的Ie/Im和顳葉素B誘導(dǎo)的脂質(zhì)分離的增加；即。，可以得出PPDPC在膜中聚集的結(jié)論。然而，當(dāng)考慮淬火過程的影響時(shí)，解釋變得更加復(fù)雜。

圖3：通過芘標(biāo)記的磷脂PPDPC（X）0.01）的熒光和DPH（X）0.002的穩(wěn)態(tài)發(fā)射各向異性r評估顳葉素B對LUV中脂質(zhì)動力學(xué)的影響，顯示為具有XPOPG）0（0）、0.10（9）、0.20（B）和0.40（2）的SOPC脂質(zhì)體中歸一化準(zhǔn)分子與單體比率r（Ie/Im）（圖A）和各向異性r（圖B）的變化，Xchol）0.10（3）。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表三次測量的平均值。標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.02（面板A）和0.004（面板B），為清楚起見，未顯示。否則情況如圖2圖例所示。

圖4：通過芘標(biāo)記的磷脂PPDPC（X）0.01的熒光評估顳葉素L對LUV中脂質(zhì)動力學(xué)的影響，分別顯示為芘單體和準(zhǔn)分子發(fā)射強(qiáng)度Im（圖A）和Ie（圖B）的變化。脂質(zhì)體由SOPC組成，XPOPG為0（0）、0.10（9）、0.20（b）和0.40（2），Xchol為0.10（3）。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表三次測量的平均值。標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.02，為清晰起見，未顯示。否則情況如圖2圖例所示。